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實時熒光PCR探針的修飾類型

2021-11-01 16:15:30

文章來源:IVD技術咖

作者:技術小咖


為了增強熒光qPCR檢測能力及其適用范圍,在探針修飾上便有各種類型。由常規的TaqMan探針到MGB探針,再到雙淬滅、鎖核酸和肽核酸,名稱上確實各有特點,那它們實際上又有啥優勢呢?


、TaqMan探針

1.結構

TaqMan探針是一種雙標記、自淬滅的水解探針,其5’端標記一個熒光基團(如FAM、HEX等),3’端則標記一個淬滅基團(如TAMRA、BHQ等)。

其中,淬滅劑的發展,便經歷了一番選擇進化。TAMRA是最早出現的淬滅劑,其與FAM熒光基團的配對使用,實現了實時熒光檢測的目的。但TAMRA作為一種自身帶有熒光的淬滅劑,背景信號較高,與其配對使用的熒光基團波長選擇范圍較窄,應用便大受所限。

后來,開發出了一類暗淬滅劑(Dark Quenchers),如DABCYL。該類淬滅劑在可見光譜中不存在發射光,且與熒光淬滅劑(如TAMRA)不同,其從熒光基團吸收的激發能量以熱能而非光能的形式耗散,從而降低了背景信號。但DABCYL也只能吸收很小范圍內的波長,這便限制了其在多重qPCR中的應用。

為了滿足多重qPCR應用,黑洞淬滅劑(Black Hole Quencher, BHQ)便應運而生。BHQ可在較長的波長下起作用,在可見光譜中具有高效的淬滅能力,與其配對的熒光基團波長選擇范圍更大?,F有BHQ染料的淬滅波長范圍可兼顧430 nm~730 nm,不同的BHQ搭配不同的熒光基團,便可實現多重qPCR檢測。而為了規避專利或改進淬滅效果,一些公司也自行開發了其他類似的淬滅劑,如IDT(Integrated DNA Technologies)公司的淬滅基團:IBFQ(Iowa Black?? FQ)和IBRQ(Iowa Black?? RQ)。

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2.原理

實時qPCR是基于熒光共振能量轉移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)原理實現檢測的,即當探針處于完整狀態且因折疊卷曲而使熒光基團和淬滅基團相對靠近時,淬滅基團可吸收熒光基團發射的熒光,導致儀器無法檢測到信號;當探針結合至靶標序列上,并在擴增過程中被Taq酶水解時,其熒光基團釋放至反應體系中,與淬滅基團分離,此時熒光基團在激發光作用下生成的信號便可被儀器檢測到。

二、MGB探針

1.結構

MGB探針除了兩端分別標記有熒光基團和淬滅基團外,探針的3’或5′末端還連接有小溝結合物(Minor groove binding, MGB),其中,標記的淬滅基團為不發光淬滅基團(non-fluorescent quencher, NFQ),MGB多為小分子三肽,可非共價結合至雙鏈DNA的小溝處,穩定DNA結構。

MGB探針包含MGB-TaqMan探針、MGB-Pleiades探針和MGB-Eclipse探針三種類型。TaqMan-MGB探針是在TaqMan探針基礎上,于其3’末端再連接上MGB,從而作為一種水解探針,在擴增過程中被Taq酶水解后釋放熒光基團產生信號。Pleiades-MGB探針的5’端標記熒光基團并連接上MGB、3’端標記淬滅基團;Eclipse-MGB探針則在其5’端標記淬滅基團并連接上MGB、3’端標記熒光基團。Pleiades-MGB探針和Eclipse-MGB探針均為雜交探針,5’端連接的MGB可阻止其被Taq酶水解,因此該兩種探針在與靶標序列雜交后,熒光基團和淬滅基團相對遠離,產生熒光信號。

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2.優

(1)MGB修飾的探針與靶標序列結合的Tm值可提高15~30℃,允許設計的探針序列更短;

(2)MGB探針采用不發熒光的淬滅基團(NFQ),可極大消除傳統淬滅基團產生的背景熒光,提高信噪比;

(3) MGB結合至DNA雙鏈小溝處,可穩定AT-rich序列,降低靶標序列Tm值對實驗的影響;

(4)MGB探針可以用于檢測短片段的保守序列,也可用于檢測SNP,一般將突變位點設計在探針中間1/3位置上,可用于區分單堿基突變;

(5)使用Pleiades-MGB探針或Eclipse-MGB探針檢測后,其擴增后的產物還可進行熔解曲線分析。


三、雙滅探針

1.結構

傳統單淬滅探針的5’端為熒光基團、3’端為淬滅基團,雙淬滅探針則在探針內部額外添加第二個淬滅基團,使得淬滅效果更加完全。

以IDT雙淬滅探針為例,其在探針的第9或10位堿基連接上第二個淬滅基團:ZEN??淬滅劑或TAO??淬滅劑。

ZEN雙淬滅探針含有一個5′端熒光基團,一個3′端Iowa Black? FQ(IBFQ)淬滅基團,以及專有的內置ZEN淬滅基團,其最常用的5′端熒光基團包括FAM、TET、Yakima Yellow、SUN或HEX。

TAO雙淬滅探針帶有一個5′端Cy 5熒光基團,一個3′端Iowa Black RQ (IBRQ) 淬滅基團,以及專有的內置TAO淬滅基團。

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2.優勢

(1)雙淬滅探針具有雙重保障,除了在探針3’端具有普通淬滅基團外,其內部還添加有第二個淬滅基團,可降低本底信號,提高信噪比;

(2)傳統探針長度一般為20~30bp,雙淬滅探針可設計得更長,達到40個堿基;

(3)雙淬滅探針在多重qPCR檢測時,可降低多通道檢測中熒光信號的相互串擾;

(4)雙淬滅探針還可增強雙鏈結構的穩定性,阻止核酸外切酶的酶切作用,且無細胞毒性,使其可應用于anti-miRNA序列以及miRNA、mRNA等的原位雜交。


四、鎖核酸探針

1.結構

鎖核酸(Locked nucleic acid, LNA)是一類經過修飾的高親和力RNA類似物,其2'-O和4'-C位之間通過亞甲基(下圖藍色部分)連接,限制了呋喃核糖環的靈活性,將其“鎖定”為剛性的雙環結構,但不影響其遵循Watson-Crick堿基配對原則,同樣可與互補的DNA或RNA雜交形成雙鏈體。

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2.優勢

(1)LNA的合成與標準寡核苷酸合成相容,可直接將單個或多個 LNA 核苷酸位點,選擇性摻入探針序列中,對探針識別能力和Tm值進行調整;

(2)添加LNA核苷酸可提高探針與靶標序列結合的熱穩定性,每加入一個LNA核苷酸,探針Tm值可升高2~8℃,因此探針長度可以設計得更短,對序列GC含量的依賴性也更低;

(3)同樣的序列,經LNA修飾的探針Tm值更高;相同的Tm值,經LNA修飾的探針序列則可設計得更短,這使得LNA探針非常適用于檢測長度較短或相似度較高的靶標序列;

(4)LNA探針具有高識別能力和親和力,可顯著提高完全匹配和錯配堿基之間的Tm值差異,能夠更有效地分辨SNP;

(5) LNA具有高核酸酶抗性,在體內和體外均較為穩定,可應用于反義技術。


五、肽核酸探針

1.結構

肽核酸(Peptide Nucleic Acid, PNA)是一種人工合成的DNA類似物,結構上保留了DNA的堿基和脫氧核糖,只是原本的核糖-磷酸骨架被類似肽鍵的酰胺鍵骨架(圖中紅圈標注)取代。因此,PNA依然遵循堿基互補配對原則,而骨架則由原本的負電性轉為近中性,減弱了雙鏈核酸之間的靜電斥力作用,使得LNA與DNA或RNA的結合穩定性和特異性均大為提高。而且,PNA的酰胺鍵骨架不易被核酸酶和蛋白酶水解,使其在體內和體外均極其穩定。

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2.優勢

(1)PNA探針具有更高的Tm值,相比常規DNA-DNA序列,每增加一個PNA堿基,其Tm值相應提高至少1℃;

(2)PNA的電中性骨架,可減少其與DNA和RNA鏈的靜電排斥作用,使得PNA與靶標序列具有更高的親和力;

(3)PNA具有高特異性高靈敏度,一個堿基對的錯配可使 Tm 值明顯降低,可用于區分單堿基突變;

(4)PNA具有良好的穩定性,在高溫或高pH條件下,可穩定存在;且由于沒有核酸酶和蛋白酶的識別位點,因此對酶降解的抗性也更強;

(5)PNA與靶標序列的雜交結合強度不依賴于鹽離子濃度,雜交速率更快,可提高100-5000倍。


六、小結

對于探針的改進,一方面是為了提高檢測信噪比,使得結果更加靈敏特異;另一方面是為了增強探針設計的靈活性,使其應用范圍更加廣泛。

而對標準核苷酸的人工改造,則給其帶來了更多的可能性,不僅可大大擴寬寡核苷酸探針的應用范圍,甚至可為人工合成的寡核苷酸開拓新的應用領域,也可使其應用方向更加可控。



參考資料

[1] Navarro E, Serrano-Heras G, Castao M J, et al. Real-time PCR detection chemistry. 

[2] IDT官網.

[3] Qiagen官網.

[4] 賽百盛官網.

[5] Panagene官網.




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